單克隆抗體的簡述以及單克隆抗體制備的流程和篩選策略
?單克隆抗體:由一個B細胞克隆或其雜交瘤或通過分子生物學手段克隆構建單個抗體基因轉染的細胞系產生的,只能識別一種抗原表位的高度均一的蛋白抗體。
不管是制備單抗還是多抗,抗原的設計與制備都是一個非常重要的問題,設計或者制備得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來??乖暮脡臎Q定是否能夠成功制備特異性的抗體。
制備好抗原后,就要進行動物免疫了,免疫這一步除了動物自身的因素外,還要有良好的免疫計劃才能得到更好的免疫效果。
惡性腫瘤是目前全世界的主要死亡原因之一,傳統的放療、化療等治療手段治療效果并不理想,后期復發率很高。 隨著生物技術的飛速發展以及科研人員對人體免疫系統認識的逐步深入,CAR-T細胞免疫療法作為治療惡性腫瘤的“第五大療法”應運而生。該療法沒有通常放、化療的毒副反應,也不會出現耐藥性。
NK 細胞研究
血液細胞分類和細胞生物標記
NK細胞又稱為自然殺傷細胞,屬于大顆粒淋巴細胞,來源于骨髓,占外周血淋巴細胞的5%~15%,是重要的免疫細胞??茖W家在1975年首次鑒定到了NK細胞,這類細胞能夠在缺少T、B細胞的情況下直接殺傷腫瘤細胞。與具有細胞毒性的CD8+T細胞不同,NK細胞殺傷腫瘤細胞時不需要預先致敏可以直接殺傷MHC陰性的腫瘤細胞,這使得NK細胞在過繼細胞免疫治療中被廣泛應用。但NK細胞在外周血淋巴細胞中所占的比例相對較低,所以有必要對種NK細胞進行體外擴增,用于研究NK細胞的功能并為細胞免疫治療提供支持。
近年來發現其它細胞因子同樣可以調節NK細胞的活性以及分化。IL-12 p70可以誘導激活,刺激細胞毒殺傷以及INFγ和TNF的產生; IL-7可以促進NK細胞分化和誘導產生細胞毒性淋巴細胞的標志蛋白;IL-18能夠上調NK細胞的細胞毒性,從而提高NK細胞的殺傷活性。
將NK細胞與靶細胞(通常是K562細胞)共培養,然后通過檢測靶細胞釋放的酶或者用CAM、CFSE標記靶細胞,通過檢測熒光,從而得出NK細胞的殺傷活性。
血液細胞分類和細胞生物標記
諾為生物提供的甲基纖維素培養基(ClonaCell-HY培養基D)將雜交瘤細胞的挑選和克隆步驟結合在一起,從而將生成單克隆抗體所需的時間減少到19天。
小鼠 B 細胞Markers
抗原特異性T細胞是研究免疫系統的獨特工具。一但經外來病原體或腫瘤侵入活化免疫系統,抗原特異性T細胞通過自身T細胞受體 識別腫瘤抗原,具有選擇性識別腫瘤抗原、分裂增殖和持續提供長期免疫保護的能力,在治療病毒感染疾病和惡性腫瘤方面具有許多潛在的益處;因此在腫瘤免疫治療與疫苗開發上為一重要的細胞研究方向。
小鼠 粒細胞 markers
小鼠 巨噬/單核細胞 markers
小鼠 巨核細胞/血小板 markers
小鼠 NK/ILC markers
如何干掉感染的傳染性病毒?
小鼠 NKT/γδ Tcell markers
小鼠 CD4 T Cell Markers
小鼠的 CD8 T Cell Markers
自然殺傷細胞(Natural Killer,NK)被視為天然免疫系統里的重要成員,具有快速產生效應細胞因子和殺死病毒感染或腫瘤細胞的能力。然而至今也愈來愈多的研究顯示, 部份的NK細胞具有很強的適應環境變化能力及最終分化成生命周期長、高度功能的特殊細胞群。
小鼠的 DC 細胞Markers
B細胞激活與T細胞激活一樣,也需要兩個信號。 第一個信號由B細胞受體(BCR)提供,B細胞受體(BCR)是與其相關抗原結合的表面表達的抗體。 也可以使用抗IgM或IgD抗體模擬該信號。 第二信號通過諸如CD40和細胞因子信號傳導的共刺激分子的結合來實現。 或者,細菌細胞壁的成分,例如脂多糖(LPS)和具有高度重復性分子的抗原,可能直接發出B細胞活化的信號。
T細胞激活需要至少兩個信號才能完全激活。 第一種發生在抗原主要組織相容性復合體(MHC)與T細胞抗原特異性受體(TCR)結合之后,第二種發生在隨后的共刺激分子的結合之后。 最有效的T細胞共刺激劑是CD28。
新病原體的出現和傳播是對人類健康的持續威脅。疫苗接種可以提供積極和持續的保護,但新疫苗的開發是一個緩慢的過程。雖然早期有科學家提出從超免疫血清注射多克隆免疫球蛋白來進行病毒預防和治療,但這種方法仍然存在諸多問題。而單克隆抗體是超免疫血清的理想替代品。
調節性T細胞(Regulatory T Cells, Tregs)是一類專職抑制免疫活性、維持機體免疫平衡的免疫細胞。雖然含量較低而且將Treg作為單獨一類T細胞開展研究直到90年代才開始,但Treg在免疫調節中的重要性不容忽視。除針對Treg開展的基礎研究,基于Treg的細胞治療方案應用于過度免疫激活引發的組織損傷、自身免疫疾病也正成為免疫細胞治療的熱點分支。
巨噬/單核細胞研究 目錄
小鼠脾臟巨噬細胞流式細胞分析方案
粒細胞研究 目錄
DC細胞研究 目錄
該應用方案中,利用Treg 擴增試劑盒,人,有效擴增 CD4+CD25+CD127dim/– Treg細胞分離試劑盒分離的Treg表達Foxp3。它包括一個Treg細胞完整的工作流程,描述從外周血單個核細胞(PBMCs)分離人Treg細胞,細胞體外擴增,以及隨后的流式細胞分析。
該應用方案描述了可靠和高效的小鼠TH細胞分化的完整工作流程,從單細胞制備開始,然后分離初始CD4T細胞并體外激活和分化,通過綜合細胞分析。
新型冠狀病毒肺炎在各地快速蔓延,對人體最大的危害是攻擊人的免疫系統,導致淋巴細胞下降,肺功能受損,危重病人甚至因為呼吸衰竭而死。同時也有很多病人因為免疫力下降,導致并發癥,多器官衰竭而亡。目前無特效藥可治愈新冠肺炎,在多方開發新藥、新疫苗或臨床試驗老藥新用的同時,開展NK細胞治療提升患者免疫力是目前極為可行的治療和預防策略。
病毒感染常是導致免疫缺陷患者致死或致殘的主要原因。動物實驗及臨床研究均已證實病毒特異性T細胞在控制病毒感染中的作用,因此在進行免疫重建及抗感染治療的研究中得到廣泛關注。
利用病毒表面蛋白抗原進行免疫細胞體外刺激并獲取、分析抗原特異T細胞將為該病毒對免疫調節的基礎研究和疫苗研發提供重要的實驗方法。
單克隆抗體在醫藥治療上具有廣泛的前景,可用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應等多種疾病。
免疫耐受通過主導機制(Dominant Mechanism)和退行機制(Recessive Mechanism) 實現即時的機體免疫調制。退行機制是細胞自發性的過程,令能識別并對自身引起免疫響應的細胞去除或使其失去免疫功能(anergy),亦或增加細胞表面抑制性抗體提高其激活閾等途徑;主導機制,這是由特定細胞群體主動對免疫細胞激活、擴增和發揮功能進行積極抑制的過程,因此可對免疫反應的強度和持續性進行調控。
調節性T細胞(Treg)除了在外周血內存在,對免疫反應發揮抑制性調節作用之外,越來越多的研究表明,在如小腸、皮膚等多種組織內存在Treg (Tissue-resident Treg)。這些特定組織形成獨特的“功能微環境”,也為身處該環境的Treg帶來了組織標簽。
該應用方案中,利用PanT細胞分離試劑盒直接從人PBMC中分離出Pan T細胞,然后用人T細胞活化和擴增試劑盒進行活化和擴增。 流式細胞儀在不同時間點對T細胞純度、增殖和活化標記表達進行評估.
NK細胞無需預先致敏,便可通過快速激活一系列NK激活受體來識別和裂解腫瘤細胞。此外,異體NK細胞在造血干細胞移植(HSCT)中識別和殺傷急性髓性白血病(AML)中的作用,亦促進了基于自體/異體NK細胞,甚至是基因工程改造的NK細胞(如CAR NK),應用在高危癌癥患者的免疫細胞治療的開發;目前也已在1/2期臨床試驗中。隨著人們對NK細胞研究不斷深入,基于NK細胞的免疫治療在新的抗腫瘤治療策略中具有重要意義。
ED克隆抗鼠抗體已經被專門設計用來識別巨噬細胞。
巨核/血小板研究 目錄
Inaba法,Son法,Lutz法
人 NKT/γδ Tcell markers
人 NK/ILC markers
人 巨核細胞/血小板 markers
人 巨噬/單核細胞 markers
人 粒細胞 markers
人的 DC 細胞Markers
人 CD8 T Cell Markers
人 CD4 T 細胞Markers
人 B 細胞Markers
T細胞產生IL-17(也稱為IL-17A)是防止某些病原體所必需的。2000年一片文獻研究表明IL-17A是由一群獨特的T輔助細胞產生的。隨后的研究明確了一群獨立于Th1或Th2細胞的獨特T細胞亞群,可在體外和體內分化成產生IL-17的細胞,由此建立Th17細胞作為獨特的T輔助細胞譜系。在功能上,Th17細胞通過介導嗜中性粒細胞和巨噬細胞向受感染組織的募集,在抗宿主細胞病原體的宿主防御中起作用。此外,Th17細胞的異常調節可能在多種炎癥和自身免疫病癥的發病機制中起重要作用。
DC細胞亞群標志物
10色T細胞亞群抗體檢測配色方案
人DC細胞解決方案
小鼠DC細胞的Markers和相關的分選方法以及培養相關細胞因子
Other cell type markers
CD45 CD45RO CD45RA CD45.1 CD45.2 的區別以及功能應用
小鼠骨髓來源樹突狀細胞(BMDC)制備方法簡圖
人外周血單核細胞來源樹突狀細胞(MoDC)的制備
DC細胞表面有如此豐富多彩的蛋白分子,充分了解DC細胞及其分子譜,才有機會充分利用DC細胞,開發治療方法如DC疫苗等。
調節性T細胞(Treg)經CD3\CD28\CD2刺激活化后能夠抑制應答細胞CD4+CD25-( Tresp)和CD8+ T細胞的活化和增殖。Treg一旦被活化,其免疫抑制作用即為非抗原特異性,并且這種免疫抑制性不具有MHC限制性,能夠抑制同種同型或同種異型CD4+CD25-(Tresp)和CD8+T細胞的活化、增殖。除此之外,Treg還能對NK細胞的增殖、細胞因子分泌、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、B 細胞等免疫活性細胞起到抑制作用。
Treg細胞可以通過特異性標記CD4\CD25\CD127或者胞內轉錄因子FoxP3抗體(#17-4776-41)進行流式鑒定。由于FoxP3是胞內表達,因此檢測時,需要進行破膜處理。Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set(#00-5523-00)專利配方設計和優化,可使用抗體對轉錄因子和核蛋白(例如 FoxP3 和 Ki-67)以及細胞因子和趨化因子進行核內染色。
免疫T細胞表達CD3 特異性蛋白,利用CD3抗體通過流式鑒定T細胞。
分離后的T細胞可通過CD3/CD28共刺激信號或者PHA和Con A進行激活。
T細胞是來源于骨髓,在胸腺職工分化、發育成熟的一種淋巴細胞。
細胞融合后,一旦鑒定可以產生目標抗體,就應立即進行克隆化,確保能分離出單個細胞重新形成克隆。
融合細胞后,對克隆細胞上清檢測,篩選分泌抗體的雜交瘤細胞。
細胞融合指兩個或者多個細胞的原生質體融合形成一個雜種細胞的過程。廣義上的細胞融合可以是同種屬的細胞發生,也可以是不同種屬的細胞發生。
介紹制備單抗的培養基體系以及配制。
在體外培養細胞實驗中,對于難養的細胞或者數量較少的細胞,常常需要預先在培養瓶或培養板底部加入一些活的原代細胞或者靜息的腫瘤細胞以輔助目的細胞的生長,這就是飼養層細胞。在單抗制備過程中,剛剛融合的細胞和克隆化的細胞都比較難以生長,因此都需要添加飼養層才能較快地生長。
T 細胞分選
血液細胞分類和細胞生物標記